CRISPR/Cas这项明星技术自问世以来，已经吸引了无数欢呼和掌声。在短短两三年之内，它已经成为了生物科学领域最炙手可热的研究工具。CRISPR/Cas技术的先驱者们，包括张锋以及两位**科学家珍妮弗·杜德娜和艾曼纽·夏邦杰，更是获得了众多荣誉和奖项。

那么，获得科研人员们如此青睐的CRISPR/Cas技术究竟是什么？

CRISPR/Cas系统是在原核生物中发现的适应性免疫系统， 全称是簇状规则间隔的短回文重复序列（CRISPR）和相关蛋白（Cas）构成的CRISPR/Cas系统。

今天就带大家首先了解一下CRISPR/Cas系统中的各类蛋白。Cas是CRISPR相关蛋白的简称。在CRISPR系统中含有很多种类的常见Cas蛋白，Cas1到Cas10以及如Cas8a1、Cas12a、Cas13a等比较稀少的类型。

图1 Cas蛋白家族分类（Kira S. Makarova et al. 2017）。

依据Cas基因与位点结构之间的序列相似性将 CRISPR/Cas 系统分类，包括两个大类五型系统：

第一类系统（包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型）存在于细菌和古生菌中，通常形成多亚基蛋白⁃crRNA（CRISPR RNA）效应复合物；

第二类系统（包括Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ型），依赖于一个单一的crRNA引导蛋白进行目标干扰，即由一个单一的多域蛋白行使功能。

换而言之，划分一类和二类CRISPR/Cas的标准就是看它的效应物的结构是不是特别简单。第二类CRISPR/Cas系统的效应物无一不是一个蛋白质就能单枪匹马完成所有的剪切任务的。而第一类CRISPR/Cas则是由多个蛋白组成复合体来执行切割功能的。

图2 不同种类的Cas蛋白在不同种类的菌体中含量统计图（Zhongjie Tang et al. 2019）。

上图2则是CasPDB数据库统计的在不同种类的菌体中所含的Cas蛋白数量分布，在统计的所有 Cas 蛋白中，Cas1占20.11% ，Cas2占17.46% ，Cas3、 Cas5、Cas6 和 Cas7占10% 以上。其余的较少，最著名的Cas9蛋白则在所有Cas蛋白中占2.59%，本文也将重点讨论Cas9蛋白和Cas12、Cas13和Cas14这类能够独立对DNA/RNA进行切割的效应蛋白。

Cas家族蛋白

Cas1与Cas2蛋白是CRISPR系统中的核心蛋白，该类蛋白参与免疫过程第一阶段外源片段的整合，而Cas3具有DNA的切割活性和解旋酶活性，是I型CRISPR/Cas系统中的核心酶，Cas4参与了外源DNA序列插入到细菌的DNA中的过程，主要存在于II-B和I-A/B/C/D型CRISPR/Cas系统中。Cas5 蛋白和其他蛋白形成Cascasde复合物来发挥功能，例如在大肠杆菌(I-E型)中，生成的crRNA-Cas6复合物会募集1个Cse蛋白、2个Cse2蛋白、6个Cse7蛋白和1个Cas5蛋白。Cas6负责将pre crRNA加工成成熟的crRNA。Cas7和Cas8都是Cascasde复合物的重要组成蛋白。

Cas10负责切割DNA链，是III型CRISPR/Cas系统的核心酶，Cas10通过和其他多个Csm/Cmr亚基及一条crRNA(CRISPR RNA)组装成效应复合物。该效应复合物既可以降解RNA也可以降解DNA(ssDNA)。Cas11主要参与crRNA的结合，常见于III型CRISPR/Cas系统中。

除了上述这些Cas蛋白以外，Cas9、Cas12、Cas13和Cas14都是第二类系统中的核心单酶，已经被广泛开发应用于基因编辑等技术中。接下来就给大家详细介绍一下：

Cas9蛋白

Cas9是一种DNA内切酶，Cas9内切酶必须在向导RNA分子的引导下对DNA进行切割，这是因为这些向导RNA分子含有与靶DNA序列互补的序列，称之为PAM序列。Cas9蛋白精确的平端切割位点位于PAM上游3个核苷酸位置，形成平末端产物。Cas9蛋白的HNH结构域负责切割与crRNA互补配对的那一条DNA链，而RuvC结构域负责切割另外一条非互补DNA链。最终在Cas9的作用下DNA双链断裂（DSB）形成双链DNA缺口，然后细胞会借助同源重组机制(homologous recombination)或者非同源末端连接机制(non-homologous end joining)对断裂的DNA进行修复，进而实现DN**段的敲除或敲入。

图3 CRISPR/Cas9基因编辑机制图

Cas9的应用：

Cas9含有两个具有切割活性的结构域：HNH结构域和RuvC结构域，其中HNH结构域切割与crRNA互补的DNA链，而RuvC结构域切割非互补链。RuvC结构域可分为三个亚结构域：RuvC I、RuvC II和RuvC III，RuvC I接近于Cas9的氨基端，RuvC II和RuvC III位于HNH结构域的两侧。仅对Cas9中的RuvC I进行突变，具体而言就是让RuvC I的两个关键氨基酸残基中的一个转换成丙氨酸（D10A或H840A），从而得到Cas9切口酶（Cas9 nickase, Cas9n）。这种切口酶不能切割非互补DNA链，仅能切割与crRNA互补的DNA链，能够明显减少脱靶效应，同时保持高效的基因修饰。

通过点突变的方式使Cas9的两个结构域RuvC-和HNH-失去活性，其中RuvC催化结构域的第10位天冬氨酸突变为丙氨酸（D10A）以及HNH催化结构域的第840位组氨酸突变为丙氨酸（H840A），Cas9蛋白将失去核酸内切酶活性，形成的dCas9只能在sgRNA的介导下结合靶基因，而不具备剪切DNA的功能。因此，将dCas9结合到基因的转录起始位点，可以阻断转录的开始，从而抑制基因表达；将dCas9结合到基因的启动子区域也可以结合转录抑制/活化物，使下游靶基因转录受到抑制或激活。因此dCas9与Cas9、Cas9 nickase的不同之处在于，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的，并不会对基因组DNA造成不可逆转的改变。

Cas12 蛋白

CRISPR–Cas12a蛋白，以前称为Cpf1，是一种内切核酸酶，可以通过向导RNA进行编程，以靶向互补的DNA序列。在与靶DNA结合后，CRISPRCas12a蛋白在每条靶DNA链中诱导切割，产生双链DNA断裂。除了诱导靶DNA的顺式切割之外，靶DNA结合还诱导非靶DNA的反式切割。因此，CRISPR Cas12a-RNA向导复合物可以提供针对入侵核酸（例如噬菌体和质粒）的序列特异性免疫。类似于CRISPR/Cas9，Cas12a已被重新用作原核和真核细胞中可编程基因组编辑和转录控制的遗传工具。此外，其反式切割活性已应用于高灵敏度核酸检测。CRISPR/Cas12a系统的脱靶率将比Cas9低得多，并且因为它与Cas9的诸多不同，它将能与CRISPR/Cas9互补，从而扩大CRISPR/Cas系统的工具箱，使基于CRISPR/Cas系统的基因编辑技术具有更强的普适性和编辑能力。

Cas12b核酸酶（又名C2c1）是依赖于RNA介导的内切核酸酶，在靶标DNA存在PAM的情况下，可特异地切割靶标双链DNA。Cas12b蛋白比Cas9和Cas12a更小，且来源于嗜酸耐热菌且切割活性较高的Alicyclobacillus acidoterrestris。Cas12b的最佳切割反应温度为48 ℃。和同家族的Cas12a类似，Cas12b也识别5'-TTN的PAM序列，切割DNA后也产生粘性末端；然而，Cas12b是双RNA导向，依赖于crRNA和tracrRNA（或连接后形成的sgRNA）。此外，Cas12b不仅可以应用于靶标dsDNA的切割，还可以用于靶标核酸的快速检测，详见HOLMESv2核酸快检技术。

Cas13 蛋白

Cas13蛋白可进一步分为4个亚型，即CRISPR-Cas13a,b,c,d。除了Cas13c的相关研究目前还不充分外，另外3中Cas蛋白已经有了比较广泛的研究和应用。

Cas13a核酸酶（又名 C2c2）是依赖于 RNA 介导的 RNA 内切核酸酶。在靶标单链 RNA 存在 PFS序 列的情况下，可特异地切割靶标 RNA。此外，Cas13a 还具有依赖于靶标单链 RNA 的反式切割活性，可用于开发靶标核酸的快速检测试剂盒。例如，MIT的张锋团队便利用 Cas13a 蛋白开发了名为“SHERLOCK”的下一代分子诊断系统。对于细菌而言，Cas13a这种反式切割活性是有意义的。若细菌被噬菌体感染，它能够激活程序性细胞死亡或休眠状态，以限制感染在整个群体中的传播。像Cas13a一样，Cas13b仅需要单个向导RNA就能靶向目的序列，此外，Cas13b能够同时靶向多个RNA转录本。

而此后发现的Cas13d，具有更高的效率、更低的脱靶率，更重要的是，Cas13d相比其他Cas13家族成员具有更小的尺寸，能够更容易包装到病毒载体中，因此具有更好的递送优势和应用前景。

Cas14 蛋白

除了上述几种具有靶向切割能力的Cas蛋白之外，近期发现的Cas14 也具有类似的功能。

Cas14a核酸酶是一种内切核酸酶，其在tracrRNA:crRNA（或sgRNA）的引导下，特异结合并切割靶标ssDNA，且无需PAM位点。相比于其他的Cas蛋白，Cas14蛋白的分子量普遍较小（400-700aa）；与Cas12类似，Cas14a也可以结合靶标核酸并激活其ssDNA反式切割活性。研究人员认为，Cas14的切割对象是单链DNA，而不是双链DNA，因此未必是良好的基因组编辑工具。不过，他们认为Cas14可用在DETECTR诊断工具中。

图4 CRISPR-Cas9、 Cas12a、 Cas14和Cas13a基因编辑系统的基本组件（Feng W et al. 2021） 。

近岸蛋白提供CRISPR-Cas9技术所需的Cas9 蛋白（目录号：E365）及其突变体蛋白，包括Cas9(D10A) Nickase（目录号：E366）、Cas9(H840A) Nickase（目录号：E367）和 (D10A，H840A)Nuclease（目录号：E368）。近岸蛋白还提供LbaCas12a Nuclease（目录号：E373） 和 LwaCas13a Nuclease（目录号：E381），多种类的Cas蛋白是您科研道路上的得力帮手。同时，近岸蛋白还提供系列T7EI工具酶及sgRNA合成试剂盒等CRISPR/Cas9相关科研产品。

引用文献：

Feng W , Newbigging A M , Tao J , et al. CRISPR technology incorporating amplification strategies: molecular assays for nucleic acids, proteins, and small molecules[J]. Chemical Science, 2021.

Makarova,K.S.,Zhang,F.,&Koonin,E.V.(2017). SnapShot:class 1 CRISPR-Cas systems. Cell,168(5), 946-946.

Makarova,K.S.,Zhang,F.,&Koonin,E.V.(2017). SnapShot:class 2 CRISPR-Cas systems.Cell,168(1), 328-328.

Tang,Z., Chen,S.Q., Chen,A. et al.(2019). CasPDB: an integrated and annotated database for Cas proteins from bacteria and archaea. Database Vol. 2019: article ID baz093; doi:10.1093/database/baz093