常州大学药学院生物材料与纳米医学课题组负责人招秀伯教授利用MicroFab的Jetlab 4xL喷墨打印系统在RSF表面上图案化自组装的I3K肽纳米纤维，以定向控制PC12细胞的生长。研究表明肽微图案可以有效地引导RSF支架表面的细胞排列和组织，为神经再生应用提供了巨大的潜力。

介绍
人类神经系统由中枢神经系统（CNS）和外周神经系统（PNS）组成，它们很容易受到创伤和车祸等伤害以及阿尔茨海默病、帕金森病、中风和脑瘤等疾病的损害，开发用于神经组织再生的明确功能支架以帮助指导神经细胞附着、排列、扩散和增殖至关重要。微图案化技术已经引起了人们的关注，它可以实现神经元细胞排列的几何控制。喷墨打印是一种成本效益高且灵活的微图案化技术，能够以高精度图案化复杂的几何形状。招秀伯教授团队利用MicroFab的喷墨打印系统Jetlab 4xl在再生丝素蛋白（RSF）表面图案化自组装肽纳米纤维，以指导神经元PC12细胞的生长，如图1所示。

▲ 图1 微图案引导细胞生长研究示意图。

MicroFab的Jetlab 4xl喷墨打印系统配有60μm的喷头，使用90V的电压、300Hz的频率打印I₃K肽纳米纤维墨水，打印高度约为10mm。为了研究打印的I₃K肽纳米纤维图案对PC12细胞生长的影响，打印形成了图案“SHEF”，如图2所示。通过将自组装的I₃K肽纳米纤维喷墨打印到RSF基底上来对PC12细胞进行微图案化，可以提供一种好的方法来分析体外轴突发育。

▲ 图2 A. 使用I₃K肽（3mg/mL）作为墨水，在RSF涂层的玻璃表面（40mg/mL）上喷墨打印1层“SHEF”字母，PC12神经元细胞沿着打印的字母生长；B. 放大的字母“HE”（比例尺500μm)。

细胞粘附过程的第一步是细胞-聚合物相互作用，这对细胞通讯、调节、组织发育和维持至关重要，通过AFM对附着在不同比例的RSF/I₃K支架上的细胞形态进行了研究，细胞在仅I₃K涂覆的表面上显示出极好的铺展如图3a所示，而在仅RSF涂覆的表面几乎没有铺展其末端如图3b所示。图3（d-g）通过将沉积在RSF（40mg/mL）涂层表面上的I₃K的浓度从2mg/mL增加到4mg/mL，细胞扩散显著改善，表明细胞扩散的肽浓度依赖性。FITC、phalloidin和DAPI分别用于染色肌动蛋白丝和细胞核，以进一步表征粘附在RSF/I₃K支架上的细胞的形态，如图4所示。

▲ 图3 附着在一系列RSF和I₃K涂层表面的PC12神经元细胞的AFM峰值力误差图像。

▲ 图4 附着在不同比例RSF/I₃K涂层表面的PC12神经元细胞的F-肌动蛋白染色。

PC12细胞在样品表面（I型胶原；RSF；RSF/I₃K 40:3和RSF/I₃K 40:4）上的代谢活性在培养24、72和144小时后使用雷沙苏林测定法测定，如图5所示。在所有表面上观察到代谢活性在24至144小时之间逐渐增加，对于RSF/I₃K支架，代谢活性增加更多，表明I₃K可以促进PC12细胞增殖，涂层表面上有极好的细胞增殖。

▲ 图5 雷沙苏林测定法评估粘附着在不同表面上的PC12细胞的代谢活性。

结论
使用I₃K肽纳米纤维作为细胞吸引剂来修饰RSF支架表面，以促进神经元细胞（PC12细胞）的附着和生长，I₃K肽的存在促进了PC12细胞的结合效率，带正电荷的赖氨酸残基促进了细胞附着。喷墨打印已被证明是用于引导细胞附着的好的微图案方法，为分析和理解基本细胞功能（如轴突发育和细胞-细胞相互作用）提供了一种很有前途的方法。


参考文献：
[1] Sun W ,  Taylor C S ,  Zhang Y , et al. Cell Guidance on Peptide Micropatterned Silk Fibroin Scaffolds[J]. Journal of Colloid and Interface Science, 2021, 603(6).