若您有酶改造或生产的需求,请联系技术:罗15180132598(微信同号),邮箱:luodan@yeasen.com
作者:翌圣生物科技(上海)股份有限公司 2023-07-11T12:24 (访问量:10608)
若您有酶改造或生产的需求,请联系技术:罗15180132598(微信同号),邮箱:luodan@yeasen.com
上期,我们介绍了酶定向进化的突变体文库构建技术(点击查看详情)。高质量的突变体文库是定向进化的基础,与之相匹配的是高效、灵敏的突变体筛选技术手段。根据突变体酶参与反应的场所来区分,筛选技术可分为体内和体外筛选,筛选的通量和准确度正随着技术的不断升级而提升。
最传统的体内筛选是由菌株筛选衍生而来,目标酶活性与菌株生长、环境中底物代谢程度相关,性能缺陷的酶不足以支撑宿主形成单克隆,或无法使底物发生显著变化。该方法适用于筛选与细菌生长、抗生素耐受等关键代谢途径相关的酶,或可使底物发生显著颜色变化的蛋白。不过,由于微生物可调整自身代谢流以适应环境,且存在多种补偿途径,菌株表现的优势可能并非仅仅是目标酶的贡献。
2011年,David Liu团队开发了PACE系统(噬菌体辅助连续进化,Phage-assisted continuous evolution)用于T7 RNA聚合酶的驯化。PACE以M13丝状噬菌体为载体,将目标酶的活性与子代噬菌体的数量相关联。其设计原理如图1b所示,T7 RNA聚合酶基因取代了噬菌体的衣壳蛋白基因gIII,并受gIII的启动子控制,gIII基因则安装在辅助质粒上,受T7启动子控制。重组噬菌体侵染宿主后gIII启动子开放,T7 RNA聚合酶水平上升,进而介导GIII蛋白大量表达,T7 RNA聚合酶基因被包装在子代噬菌体内。聚合酶活性越高,产生的活性子代噬菌体颗粒越多,相应突变体序列便随代次增加而逐渐富集。不仅如此,PACE系统还包含了诱变质粒MP(Mutagenesis plasmid),多个诱变基因在L-阿拉伯糖的诱导下,介导包含目的基因在内的全基因组范围的碱基突变。在连续流加培养体系中,基因组上积累了突变的大肠杆菌不断被新鲜的细胞稀释取代,用来给子代噬菌体提供优质的宿主,而携带突变的噬菌体持续侵染并叠加新的突变,实现目的基因的连续筛选和进化(图1a)。利用PACE系统,项目组成功地驯化了可以识别T3启动子的T7 RNA聚合酶突变体。
图1. PACE进化系统
(图片源自:doi: 10.1038/s41596-020-00410-3.)
PACE系统凭借快速、自动化的优势被迅速推广,适用于RNA聚合酶、蛋白酶、tRNA合成酶等酶的进化,以及一些与DNA、蛋白相互作用的蛋白质的筛选(图1c)。同时,在GIII的拮抗蛋白GIII-neg的辅助下,PACE系统可以更灵活地用于提升多种酶的不同性能(图1d)。尽管如此,那些无法关联到gIII或其他噬菌体基因表达过程的蛋白依然难以用PACE系统进行筛选,并且所有会导致大肠杆菌生长异常的选择压力都难以应用。
图2. HaeIII甲基转移酶的筛选
(图片源自:doi: org/10.1038/nbt0798-652.)
图3. 分隔自复制系统
(图片源自:doi: 10.1073/pnas.071052198.)
以流式分选技术为例,只要酶性能与细胞的大小、形状、荧光强度或表面修饰状态相关联,当细胞流经监测口时仪器就能采集相关信号并借助电荷和磁场的作用,实现目标细胞的分选。而适用于微米级微生物分选的FADS(Fluorescence-Activated Droplet Sorting)及其衍生系统(AADS、BADS、MADS)则是另一种技术,为流式分选和液滴技术的结合。微生物细胞和底物分散在反应缓冲液中作为水相流入PDMS芯片中,油相则从垂直方向进入,通过调整两种液体的流速,水相被均匀地分割为20-50 μm大小的液滴。不同于耐热的CSR体系,液滴分选系统的细胞破碎只能依赖溶菌酶或其他化学试剂。为了防止细胞在进入液滴前裂解,溶菌试剂推荐使用再注入的方法输入液滴,或使用替代方案先将溶菌组分与细胞混合,再将反应底物注入液滴。随后液滴在合适条件下脱机孵育,催化反应将使液滴内的浊度、pH值、荧光信号强度、特征化合物的量发生显著变化,超过设定阈值的液滴将在电场或气流的作用下发生偏转,流入收集管内(图4)。收集的完整细胞可直接涂布培养,破碎的细胞则只能扩增回收DNA用于后续实验。
图4. 液滴分选
(图片源自:doi: 10.1016/j.tibs.2021.11.001.)
液滴分选系统具有以下优势:直接检测产物,可准确反应酶学性能的变化;皮升级的液滴反应器可大幅度节约试剂成本(~10^6倍);最多可实现10^8/day的液滴分选;可通过设计芯片结构、调整模块组合来适配多种酶的筛选场景。
针对以上介绍的不同突变体文库筛选方法总结如下表,实际可根据不同需求选择。
翌圣ZymeEditor™酶改造定制服务
翌圣ZymeEditor™是一个酶改造底层技术平台,该平台有四大关键技术:FADS荧光激活微液滴分选技术,MTPS微孔板筛选技术、CSR分割自复制技术与计算机辅助理性设计技术,这些酶改造技术在生物医药、NGS建库、IVD体外检测等领域用酶中已得到成功应用。
图5:ZymeEditor™平台四大关键技术
图6:ZymeEditor
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