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发表期刊：Nature Communications

影响因子：12.353

发表时间：2019年

合作单位：第三军医大学附属西南医院

今天百趣代谢组学将给大家分享Nature Communications上的一篇文章：ABHD5 blunts the sensitivity of colorectal cancer to fluorouracil via promoting autophagic uracil yield。

百趣代谢组学分享，氟尿嘧啶（Fu）是最常用的治疗直肠癌（CRC）的药物。然而因药物抗性，极大限制了其治疗的疗效。自噬（macroautophagy）是一种细胞分解代谢过程，自噬有潜力为附近所有代谢途径供能，为细胞提供巨大的代谢可塑性。代谢重编程和代谢酶的异常活跃被认为是恶性肿瘤的特征之一。

作者证明ABHD5定位于溶酶体后与PDIA5相互作用，防止PDIA5与RNASET2相互作用，从而使RNASET2失活。代谢组学分享，它会损害RNASET2介导的自噬尿嘧啶产量，促进结直肠癌细胞将FU作为外源尿嘧啶摄入，从而增加其对FU的敏感性。研究结果首次揭示了ABHD5在调节溶酶体功能中的新作用，对基于FU辅助化疗后的机体恢复提供了重要见解。

ABHD5降低了CRC细胞对FU的敏感性

图1 ABHD5降低了CRC细胞对FU的敏感性

采用癌症药物敏感性基因组学数据集，将ABHD5表达水平与化疗结果相关的敏感性数据集集合起来，通过Pearson’s correlations的分析方法，ABHD5表达在pMMR和dMMR CRC细胞系中都和IC50呈现正相关（图1a）。代谢组学分享，相比较与正常的癌细胞，ABHD5基因敲除的细胞（ABHD5 KD）在FU处理下IC50，细胞活力显著降低（图1b-c），细胞凋亡率显著升高（图1d）。

随后作者做了小鼠实验，通过生物发光成像和TUNEL染色，得到同样的结论，ABHD5 KD组小鼠对FU处理后肿瘤负荷明显减小（图e），并且组织中肿瘤细胞凋亡率增加（图f）。代谢组学分享，对不同的小鼠做ABHD5基因敲入和敲除后，用PBS或FU处理，每隔一段时间给小鼠和肿瘤组织称重，发现ABHD5 KD+FU处理组明显病情得到缓解（图1g-h）。再通过Caspase-3对凋亡细胞或Ki67对增殖细胞做免疫组化检测，也得到相同的结论ABHM5 KD+FU处理明显抑制了细胞的增值并表现较强的敏感性（图1i-j）。

FU辅助的化疗效果受ABHD5表达量影响

图2 ABHD5的表达以及FU辅助化疗的疗效

将NCBI-GEO数据集中361名CRCs患者分为ABHD5 high组（262例）和ABHD5 low组（99例），统计结果显示ABHD5 high可能是BRAF阳性突变（BRAF MT），p53野生型（p53 WT）和染色体不稳定阴性型（CIN-）（图2a-b）。只用FU治疗的ABHD5 high效果较好，有化疗的还是ABHD5 low组更好（图2c-d）。代谢组学分享，用另外一组大数据量进行验证，也是同样的结果，ABHD5 low组更适合FU+化疗（图e-f）。

ABHD5通过提高自噬性

尿嘧啶的产量来控制FU的摄取

图3 ABHD5影响CRC细胞对FU的摄取

通过HPLC发现ABHD5 KD细胞中FU浓度增加，WB显示PBS或者FU处理的正常癌症细胞中都没有发现TS, TP,DPD（这3个酶控制FU代谢）的变化，可能是FU浓度和药物吸收能力相关（图3a-b）。代谢组学分享，但是FU处理后，ABHD5 KD细胞尿嘧啶减少（图3c），但是尿嘧啶生物合成限速酶CPS II和UMPS没有发生变化（图3d）。ABHD5可能通过其他的方式影响了尿嘧啶的产量。

在GSE38832数据集122例CRCs，ABHD5 low组溶酶体途径相关基因是下降的（图3e），根据数据做了个热图，猜想溶酶体RNA的降解使得细胞产生了自噬，从而提高了尿嘧啶的含量（图3f）。HCS分析显示自噬体的量和FU的含量呈现负相关趋势（图3g-h）。代谢组学分享，ABHD5过表达的细胞在FU和靶向药物处理后，才使得胞内尿嘧啶和FU的浓度提高（图3i-j）。在PDX模型中BECN1激活剂对ABHD5 KD中的尿嘧啶和FU的浓度影响不是很大（图3k-l）,说明ABHD5通过其他途径调节细胞自噬。

LC-MS检测ABHD5通过

RNASET2来促进细胞自噬

图4 RNASET2调控ABHD诱导细胞自噬

采用LC-MS检测FU作用下尿嘧啶和相关的核苷含量的变化，ABHD5 KD组中核苷和尿嘧啶的含量没有什么变化，可能是RNASET2催化RNA分解过程并参与ABHD诱导细胞自噬（图4a-c）。代谢组学分享，ABHD5 KD和RNASET2 KD组中核苷产生后一会就没有了，ABHD5高表达+RNASET2 KD组中反而对FU敏感了（图4d-g）。这些结果表明，ABHD5通过RNASET2来促进细胞自噬，使得尿嘧啶含量增高。

ABHD5保护RNASET2不被PDIA5灭活

图5 ABHD5维持RNASET2的活性

通过免疫荧光染色和WB检测说明ABHD5定位于溶酶体并调节RNASET2的活性（图5a-b）。代谢组学分享，酵母双杂实验表明ABHD5不直接和RNASET2直接作用，而且ABHD5 KD的细胞中RNASET2表达量没有变化（图5c-e）。通过蛋白芯片检测，表明ABHD5与RNASET2是共同竞争结合PDIA5的关系，从而促进细胞自噬，减弱CRC细胞对FU的敏感性（图5c-m）。

结论

图6 文章机制示意图

ABHD5定位于溶酶体，并且和RNASET2共享PDIA5中的相同相互作用域。 ABHD5直接与PDIA5相互作用，以防止PDIA5直接与RNASET2相互作用并使RNASET2失活。ABHD5缺乏释放使得PDIA5直接与RNASET2相互作用，使RNASET2处于失活状态，这会损害RNASET2诱导的自噬尿嘧啶产量。 ABHD5缺乏促进CRC细胞摄取FU作为外源性尿嘧啶，从而增加其对FU的敏感性。 代谢组学分享，相反，由于自噬尿嘧啶产量增加，ABHD5使得的CRC细胞显示出对FU的抗性。

LC-MS非靶标代谢组学检测

BIOTREE LC-MS非靶标代谢组学检测通过液质联用（LC-MS）方法检测生物体受外界刺激前后体内大多数小分子代谢物的动态变化，重点寻找在实验组和对照组中有显著变化的代谢物，进而研究这些代谢物与生理病理变化的相关关系，其研究对象大都是分子量1500Da以内的小分子物质。