15min不一定能追到一个女朋友,但一定可以完成一次克隆！
——Yeasen Hieff Clone® 一步法克隆试剂盒荣登《Cell》《Science》等国际顶尖期刊
提起“分子克隆”或“载体构建”这两个词，大家可能先想到的是传统酶切酶连法，即用限制性内切酶产生黏性末端，通过T4 DNA连接酶连接两个片段的克隆方法。该方法存在着一些明显的局限，如连接反应时间长，操作繁琐，克隆效率低，酶切位点的选择易受到限制等。
为了提高克隆效率，节省反应时间，基于同源重组酶的无缝克隆技术应用而生。与传统酶切酶连技术相比，无缝克隆技术操作简单快速，不受到酶切位点的限制，可一次进行多个片段的拼接，大大的提高了克隆效率。
翌圣生物在成熟的工具酶表达纯化平台基础上，获得高纯度重组酶，并反复优化重组酶反应微环境，研发出Hieff Clone®系列无缝克隆试剂盒。
Hieff Clone®克隆试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任何载体的任何位点，可高效克隆50 bp-10 kb片段。将载体线性化，并在插入片段正、反向PCR引物5'端引入15-25 bp的线性化载体末端同源序列，使得插入片段PCR产物5'和3'末端分别带有与线性化载体两末端对应的完全一致的序列。PCR产物和线性化载体在重组酶的作用下，最快仅需反应5分钟即可用于后续转化，完成定向克隆，克隆阳性率可达95%以上。
产品优势
● 无需考虑酶切位点：不受插入片段酶切位点的限制，适用于任何载体；插入片段兼容粘性或平末端。
● 设计简单：在插入片段的PCR扩增引物5'端引入20 bp左右与载体末端同源的序列即可。
● 快速高效：50℃，最快5分钟即可完成重组反应。克隆阳性率可达95%以上。
● 应用广泛：可用于单片段或多片段定向克隆，高效克隆50 bp-10 kb片段；也可结合Canace高保真酶，应用于定点突变。
实验操作流程
①线性化载体的制备：酶切或PCR制备线性化载体
②插入片段的制备：在目的DN**段上下游引物的5'端引入15-25 bp左右载体末端同源序列；PCR反应扩增目的片段。
③重组反应：按比例混合线性化载体和目的DN**段进行重组，50℃反应5-20 min。
④转化、涂板：将重组产物直接转化后涂平板，阳性克隆鉴定。
图1：Hieff Clone®一步法快速定向克隆试剂盒进行单片段和多片段克隆实验流程图。
实验数据
★单片段高效重组（Cat# 10911）
图2：Hieff Clone® One Step Cloning Kit（Cat# 10911）可以有效克隆不同长度的单片段基因。
A-D：重组转化平板。E：插入片段和载体浓度检测电泳图。F-H：插入片段PCR鉴定电泳图。箭头指示目的条带。载体：pFastBac1，4.7 kb，插入片段大小分别是1.2 kb，3 kb和5 kb，载体与插入片段摩尔比：1:3，重组反应条件：50℃，20 min。
★多片段轻松重组（Cat# 10912）
图3：Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit（Cat# 10912）进行三片段克隆。
A：重组转化平板。B：插入片段和载体浓度检测电泳图。C：PCR方法鉴定每个单片段和最终连接基因。箭头指示目的条带。载体：pCAMIBA1302，10 kb，三个插入片段长度：1 kb，1.5 kb和2.5 kb，重组反应条件：50℃，20 min。
★单片段、五片段高效重组（Cat# 10922）
图4：Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit（Cat# 10922）可保证单片段、多片段高效克隆。
A-B：重组转化平板。C：插入片段PCR鉴定电泳图。载体：pGEX4T-1, 5 kb，插入片段长度：2 kb，摩尔比为1:3，重组反应条件：50℃，5 min。E-F：重组转化平板。G：插入片段PCR鉴定电泳图。载体：pGEX4T-1, 5 kb，五个插入片段：0.5 kb， 0.5 kb，0.5 kb，0.5 kb和1 kb，重组反应条件：50℃，30 min。
客户反馈
◆ 长片段重组
实验信息：载体大小：8000 bp，目的片段大小：7500 bp。
实验数据：
图5：使用Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit进行克隆。
A：阴性对照转化平板。B：重组质粒转化平板。C：载体和目的片段的浓度检测电泳图。D：菌落PCR鉴定电泳图，箭头指示目的条带。 M1：Marker Ⅲ；M2：100 bp DNA ladder。(仁济医院)
◆ 多片段重组
实验信息：载体大小：3996 bp；四个片段大小：576 bp，867 bp，915 bp和647 bp。
实验数据：
图6：使用Hieff Clone® Multi One Step Cloning Kit进行克隆。
A：重组质粒转化平板。B：1为载体酶切后琼脂糖凝胶电泳图。C：菌落PCR验证结果，其中1为原始质粒对照电泳，2-5为重组质粒，仅检测863bp的一个目的片段，6为假阳性。D：阳性克隆测序结果。M：Marker II。（微生物所)
FAQ
Q：Hieff Clone®克隆的原理是什么？
A：利用末端同源重组的原理。将任意线性化载体和具有与其两端20 bp左右同源序列的DN**段快速定向克隆。
Q：与传统克隆相比，Hieff Clone®克隆有什么优势？
A： 1）无需考虑酶切位点：不受插入片段酶切位点的限制，适用于任何载体；插入片段兼容粘性或平末端。
2）设计简单：在插入片段的PCR扩增引物5'端引入20 bp左右与载体末端同源的序列即可。
3）快速高效：50℃，20 min即可完成重组反应。克隆阳性率可达95%以上。
4）应用广泛：可用于单片段或多片段定向克隆，也可结合Canace高保真酶，应用于定点突变。
Q：同源序列长度对重组效率的影响？
A：同源序列的长度与克隆数目有相关性，一般同源片段选择在20 bp左右，可以在15 bp-25 bp范围内调整。并且选择尽量避免出现二级结构。
Q：线性化载体和目的片段产物的质量会影响重组反应吗？
A：线性化载体或目的片段品质较差时会极大影响重组反应，建议割胶回收纯化产物。
Q：一步法快速定向克隆试剂盒对感受态细胞有要求吗？
A：推荐使用转化效率为108 cfu/μg的感受态细胞。如Yeasen的DH5α（cat NO. 11802ES），TOP10（cat NO. 11801ES）等。
Q：线性化载体和目的片段扩增产物的使用量和比例？
A：载体使用量应大于0.01 pmol，推荐使用量0.03 pmol；克隆载体与目的片段摩尔比应在2:1-1:5范围内，最适为1:2-1:3，超过范围可能会影响克隆效率。
Q：一步法快速定向克隆试剂盒适用实验有哪些？
A：本试剂盒适用于绝大多数基于常规“酶切-连接”方法的克隆实验，并且特别适用于其它常规方法难以快速实现的基因多点突变、全基因合成等。
Q：多片段一步法快速定向克隆试剂盒可以用于单片段的克隆吗？
A：多片段一步法克隆试剂盒可以用于单片段的克隆。但是，单片段克隆试剂盒不建议用于多片段的克隆，重组效率可能会受到影响。
Q：一步法快速定向克隆试剂盒反应温度是50℃，是否可以在37℃进行反应？
A：一般情况下建议在50℃进行反应。50℃有利于消除DNA的二级结构，同时是Hieff Clone®重组酶的最适反应温度。37℃反应条件也可以进行重组反应，请根据实验需要进行优化。
部分发表文献
[1]. Jiang Y, Wang W, Xie Q, et al. Plants transfer lipids to sustain colonization by mutualistic mycorrhizal and parasitic fungi. Science. 2017. (IF47.728） [2]. Liu CX, Li X, Nan F, et al. Structure and Degradation of Circular RNAs Regulate PKR Activation in Innate Immunity. Cell. 2019. (IF41.582） [3]. Xing YH, Yao RW, Zhang Y, et al. SLERT Regulates DDX21 Rings Associated with Pol I Transcription. Cell. 2017. (IF41.582） [4]. Wang Y, Hu SB, Wang MR, et al. Genome-wide screening of NEAT1 regulators reveals cross-regulation between paraspeckles and mitochondria. Nat Cell Biol. 2018. (IF28.824） [5]. Li X, Liu CX, Xue W, et al. Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection. Mol Cell. 2017. (IF17.970） [6]. Yao RW, Xu G, Wang Y, et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus. Mol Cell. 2019. (IF17.970） [7]. Wu P, Zhang T, Liu B, et al. Mechano-regulation of Peptide-MHC Class I Conformations Determines TCR Antigen Recognition. Mol Cell. 2019. (IF1 17.970） [8]. Qiao HH, Wang F, Xu RG, et al. An efficient and multiple target transgenic RNAi technique with low toxicity in Drosophila. Nat Commun. 2018. (IF14.919） [9]. Liu C, Zheng S, Gui J, et al. Shortened Basal Internodes Encodes a Gibberellin 2-Oxidase and Contributes to Lodging Resistance in Rice. Mol Plant. 2018. (IF13.164） [10]. Du L, Dong S, Zhang X, et al. Selective oxidation of aliphatic C-H bonds in alkylphenols by a chemomimetic biocatalytic system. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017. (IF11.205） [11]. Wang M, Nie Y, Wu XL. Extracellular heme recycling and sharing across species by novel mycomembrane vesicles of a Gram-positive bacterium. ISME J. 2021. (IF10.302) [12]. Ma F, Yang X, Shi Z, Miao X. Novel crosstalk between ethylene- and jasmonic acid-pathway responses to a piercing-sucking insect in rice. New Phytol. 2020. (IF10.151） [13]. Liang C, Zhang X, Wu J, et al. Dynamic control of toxic natural product biosynthesis by an artificial regulatory circuit. Metab Eng. 2020. (IF9.783) [14]. Zou G, Bao D, Wang Y, et al. Alleviating product inhibition of Trichoderma reesei cellulase complex with a product-activated mushroom endoglucanase. Bioresour Technol. 2021. (IF9.642） [15]. Gao YQ, Chen JG, Chen ZR, et al. A new vesicle trafficking regulator CTL1 plays a crucial role in ion homeostasis. PLoS Biol. 2017. (IF8.029） [16]. Xi J, Wu Y, Li G, et al. Mir-29b Mediates the Neural Tube versus Neural Crest Fate Decision during Embryonic Stem Cell Neural Differentiation. Stem Cell Reports. 2017. (IF7.765） [17]. Li N, Hong T, Li R, et al. Cherry Valley Ducks Mitochondrial Antiviral-Signaling Protein-Mediated Signaling Pathway and Antiviral Activity Research. Front Immunol. 2016. (IF7.561） [18]. Wang Z, Xi J, Hao X, et al. Red blood cells release microparticles containing human argonaute 2 and miRNAs to target genes of Plasmodium falciparum. Emerg Microbes Infect. 2017. (IF7.163) [19]. An D, Chen JG, Gao YQ, et al. AtHKT1 drives adaptation of Arabidopsis thaliana to salinity by reducing floral sodium content. PLoS Genet. 2017. (IF5.917）
心动不如行动，快来订购吧！
订购信息
|
产品名称 |
产品货号 |
规格 |
|
10911ES20 |
20 T |
|
|
10912ES10 |
翌圣生物科技（上海）股份有限公司 商家主页地 址： 上海市浦东新区天雄路166弄一号楼三层南单元 联系人： 李自转 电 话： 400-6111-883、021-34615995-8075 传 真： 021-34615995-188 Email：lizizhuan@yeasen.com 相关咨询精品推荐 | 这款酶在多重PCR扩增体系里表现极佳！ (2024-12-24T00:00 浏览数:5240) 上新 | 做克隆，更省心！ (2024-12-24T00:00 浏览数:4948) 试用！GMP级细胞因子重组人IL-3和人bFGF重磅上市！ (2024-12-24T00:00 浏览数:5263) UCF.ME® rTEV蛋白酶：无残留精准切除蛋白标签的高效解决方案 (2024-12-24T00:00 浏览数:3859) 宿主gDNA、试剂背景核酸污染去除只需一款Thermolabile dsDNase！ (2024-12-20T00:00 浏览数:7837) IVD冻干RDC，为分子诊断“量身定制”、领先“翌”步！ (2024-12-20T00:00 浏览数:11169) 看到就是赚到！mRNA药物研发及生产流程的质量安全控制策略全公开！ (2024-12-20T00:00 浏览数:8725) 巨噬细胞清除小课堂 | 第二课：肝脏 (2024-12-20T00:00 浏览数:12203) 干货 | 收藏夹吃灰系列之克隆典型案例分析 (2024-12-20T00:00 浏览数:4658) 解决方案 | 多重PCR建库技术多领域“竞”显身手！ (2024-12-20T00:00 浏览数:11130) ADVERTISEMENT
|